Optimization of the Sybr Green real time PCR for the detection of Human Herpes Virus type 6 (HHV-6) / Otimização da PCR em tempo real - Sybr Green para detecção do Herpes Vírus Humano tipo 6 (HHV-6)

HHV-6 is the etiological agent of Exanthem subitum which is considered the sixth most frequent disease in infancy. In immuno-compromised hosts, reactivation of latent HHV-6 infection may cause severe acute disease. We developed a Sybr Green Real Time PCR for HHV-6 and compared the results with nested conventional PCR. A 214 pb PCR derived fragment was cloned using pGEM-T easy from Promega system. Subsequently, serial dilutions were made in a pool of negative leucocytes from 10-6 ng/µL (equivalent to 2465.8 molecules/µL) to 10-9 (equivalent to 2.46 molecules/µL). Dilutions of the plasmid were amplified by Sybr Green Real Time PCR, using primers HHV3 (5' TTG TGC GGG TCC GTT CCC ATC ATA 3)'and HHV4 (5' TCG GGA TAG AAA AAC CTA ATC CCT 3') and by conventional nested PCR using primers HHV1 (outer): 5'CAA TGC TTT TCT AGC CGC CTC TTC 3'; HHV2 (outer): 5' ACA TCT ATA ATT TTA GAC GAT CCC 3'; HHV3 (inner) and HHV4 (inner) 3'. The detection threshold was determined by plasmid serial dilutions. Threshold for Sybr Green real time PCR was 24.6 molecules/µL and for the nested PCR was 2.46 molecules/µL. We chose the Real Time PCR for diagnosing and quantifying HHV-6 DNA from samples using the new Sybr Green chemistry due to its sensitivity and lower risk of contamination.

HHV-6 é o agente etiológico do Exantema Súbito e considerado a sexta doença mais comum na infância. Em indivíduos imunocomprometidos, a reativação da infecção latente pode causar doença aguda ou morte. Padronizamos PCR em Tempo Real utilizando a química Sybr Green na detecção do HHV-6 e comparamos os resultados com a PCR convencional. Um fragmento de 214 pb foi clonado através do kit pGEM-T do sistema Promega. Com este clone, foram feitas diluições seriadas em um pool de leucócitos negativos a partir de 10-6 ng/µL (equivalente a 2465,8 moleculas/µL) até 10-9 (equivalente a 2,46 moleculas/µL). As diluições foram amplificadas por PCR em Tempo Real utilizando Sybr Green, com primers HHV3 5' TTG TGC GGG TCC GTT CCC ATC ATA 3' e HHV4 5' TCG GGA TAG AAA AAC CTA ATC CCT 3' e pelo método convencional, PCR nested usando primers HHV1 (externo): 5' CAA TGC TTT TCT AGC CGC CTC TTC 3'; HHV2 (externo): 5' ACA TCT ATA ATT TTA GAC GAT CCC 3', HHV3 (interno) e HHV4 (interno): 5' TCG GGA TAG AAA AAC CTA ATC CCT 3'. O limite de detecção foi determinado pelas diluições seriadas do plasmídio contendo um fragmento de HHV6: para o ensaio com Sybr Green, foi de 24,6 moleculas/µL e para a PCR nested, 2,46 moleculas/µL. Elegemos o PCR em Tempo Real - Sybr Green como método diagnóstico e quantitativo do HHV-6 devido a sua boa sensibilidade e menor risco de contaminação.

Duality of patterns in hepatitis a epidemiology: a study involving two socioeconomically distinct populations in Campinas, Sao Paulo State, Brazil

A avaliaçäo da prevalencia de anticorpos contra o virus da hepatite A em duas populaçöes com diferentes niveis sócio-economicos foi realizada pela analise de 101 e 82 amostras de soros provenientes de grupos de alto e baixo nivel sócio-economico, respectivamente, utilizando um teste imunoenzimatico comercial. A prevalência no grupo de baixo nivel sócio-economico foi 95,0 por cento enquanto que no grupo de alto nivel sócio-economico foi apenas 19,6 por cento (p < 0,001). Estes dados mostram uma dualidade no Brasil : a prevalência de anti-HAV em individuos de nivel sócio-economico baixo e similar aquela dos paises em desenvolvimento enquanto que nos individuos de alto nivel sócio-economico e compativel com o padrao de paises desenvolvidos. O controle desta infecçäo depende primariamente da melhoria das condiçöes sanitarias, mas especialmente em populaçöes de alto-nivel sócio-economico, o uso da vacinaçäo contra a hepatite A e altamente aconselhavel para evitar o aparecimento da doença em adultos

Enzyme linked immunosorbent assay for rubella antibodies: a simple method of antigen production: a preliminary report

Um metodo simples de producao de antigeno de virus da rubeola, por extracao com desoxicolato de sodio para aplicacao no ensaio imunoenzimatico, IMT-ELISA, e apresentado...

Prevalence of rubella antibodies in a non-immunized urban population, Sao Paulo, Brazil

A prevalencia de anticorpos contra o virus da rubeola foi avaliada atraves de inquerito soroepidemiologico, em 1400 amostras de sangue de criancas com idade entre 2 e 14 anos e 329 amostras de soro de cordao umbilical. Anticorpos para o virus da rubeola foram detectados pela tecnica de ELISA e as amostras foram colhidas em 1987, 5 anos antes da campanha de vacinacao em massa com a vacina triplice viral realizada na cidade de Sao Paulo em 1992. Um aumento significativo na prevalencia foi observado apos 6 anos de idade, e 77 por cento dos individuos entre 15 e 19 anos apresentaram anticorpos anti-rubeola....

Measles serodiagnosis standardization and evaluation of a Dot-ELISA

A tecnica de Dot-ELISA (DE) para deteccao de anticorpos IgM e IgG anti virus do sarampo foi padronizada e avaliada utilizando-se antigeno viral obtido por tratamento com desoxicolato de sodio (DOC). Foram estudadas 192 amostras de soros, compreendendo 47 amostras de 22 pacientes com sarampo nas fases aguda e convalescente, 55 amostras de soros de criancas antes da vacinacao, tendo 9 meses de idade, 41 amostras de soros de criancas da mesma idade colhidas apos vacinacao e 49 amostras de soros de pacientes com outras patologias....